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如何讓樣品保持在生理狀態

點擊次數:941 更新時間:2023-09-05

Coral Life工作流將動態數據與最佳的樣品固定方式(高壓冷凍)相結合。


 

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Coral Life工作流將動態數據與最佳的樣品固定方式(高壓冷凍)相結合。然而,如果您的細胞因為溫度下降,或缺氧氣、二氧化碳或營養物質缺乏而受到損傷,那么再好的樣品保存也沒有意義。這些因素將影響一系列的生物過程,甚至破壞原超微結構基礎,影響您的分析。

 

因此,徠卡顯微系統公司與Baker Ruskinn公司合作開發了一種方法,可使您的樣品從細胞接種開始到高壓冷凍,一直保持生理狀態。使用這種解決方案,樣品的生長、選擇和成像沒有任何時間壓力。本文描述了控制氧氣的重要性,以及Coral Life如何協同Baker Ruskinn公司解決氧氣控制的問題


 


 


 


為什么持續控制氧氣特別重要?

氧氣是大多數生命形態存在的基本要素。對于生命科學研究人員而言,氧氣是一種電子受體,一種生命所必需的高活性分子,以及一種影響生物中每一個單一活動和反應的分子。一般情況下,大氣含氧量被認為是21%。

 

然而,當吸入空氣時,組織氧合下降到約5%。從肝至肺上皮中,氧氣水平約為14%,腸粘膜腔實際上是無氧的。在這些百分比中,不同的組織中有不同的氧氣水平,但最重要的是,沒有一個組織的細胞會暴露在21%的氧氣水平中。事實上,21%的氧氣會形成活性氧自由基(ROS)及其中間體,因此對細胞具有高毒性。當產生的ROS超過細胞的抗氧化能力時,ROS就開始破壞大分子,如蛋白質、脂類和DNA。

 

缺氧是細胞和組織通過血流增加、血管舒張或上調氧應答基因對一定的氧氣水平作出響應,以期維持它們的氧氣水平。這些響應會在氧氣水平低于某一特定點后發生,這個點在各組織和細胞間各不相同。正常組織在3%到10%的氧氣水平之間得以維持,低于該水平被視為低氧狀態(最恰當的描述是缺氧)。

 

由于是在非生理條件下進行研究,因此,在很多,甚至可能是大部分的研究中都要隱藏生理表型。由此,了解各項研究中器官或組織的氧氣水平,以獲得可轉移的和生物學相關的實驗結果是很重要的。每個組織和器官都有各自的氧合狀態,反映了各自的功能。當氧氣含量過高或過低時,其影響涉及單基因表達到蛋白質組水平。

 

Baker Ruskinn公司的OxyGenie

OxyGenie是一個小型便攜式孵育平臺,可將您的樣品保持在缺氧狀態或您想要的空氣中。OxyGenie可以由電源以及電池驅動,不管是在實驗室,還是外面 , 您都可以控制樣品狀態。它由1至6個獨立的1孔培養室組成,每個培養室有自己的進氣口。OxyGenie配有兩個循環充氣瓶(Catalina Cylinders,美國加利福尼亞州),可以充您想要的氣體成分比例。通過調整氣瓶的出口壓力來調節氣體流量。兩個裝滿的氣瓶可供6個樣品室使用16小時。溫度由ITO加熱器和控制器(Okolab s.r.l.,意大利)控制。每個樣品室下方都有一個6孔分流器,通過該分流器,細胞可以在不中斷生理參數的情況下,例如在光學顯微鏡成像時與基底分離。

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圖1. A:Baker Ruskinn OxyGenie移動式孵化器。B:組裝硅細胞培養孔

樣品室經過優化,以實現高分辨率成像。樣品室的底座為高質量的玻璃蓋。每個樣品都是一個迷你孵化器,配有不同的蓋子和鎖。經過優化的樣品室可容納1mL的樣品培養基,并以光學透明玻璃蓋密封。蓋鎖是為了預防潛在的蒸發。外蓋鎖將蓋子牢固密封。最后一層外蓋與系統的氣體軟管連接。

 

 

為Coral Life改編

為了在整個活細胞CLEM工作流中維持合適的生理條件,我們利用了OxyGenie可以在冷凍固定之前確保細胞生理狀態的能力。然而,為了適應工作流的需要,我們做了一些定制化的改變:

 

在EM ICE上進行高壓凍結時,使用6 mm的藍寶石盤作為樣品培養皿。此外,為了實現最佳的實時成像,能否在藍寶石盤上實現水浸式成像至關重要。因此,我們將腔室底部的玻璃蓋換成一個在中心有6.5 mm孔的35 × 35 × 1 mm玻璃載玻片(稱為SampLink樣品杯)。該孔與EM ICE中間板對齊,直達藍寶石盤的中心。使用蠟封將中間板和藍寶石基底連接到SampLink基杯的底部。中間板與SampLink基杯的對齊和連接見Coral Life操作手冊的5.2節的描述。

 

成像后,EM ICE中間板必須快速脫離SampLink。因此,EM ICE加樣區配備了滑動和分離機制,可將中間板從玻璃基底分離,并將其直接放置在正確的位置進行冷凍

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圖2:為Coral Life準備的EM ICE加載區。


 

 

 


SampLink室的細胞活性和細胞毒性

為確保樣品在改良后的SampLink室中保持活性,需要開展細胞活性和細胞毒性測試實驗使用哺乳動物的成纖維細胞系L-929 (ATCC編號CCL-1,批號13),由奧地利維也納的OFI技術與創新公司執行。細胞(105細胞/ ml)接種在藍寶石盤上(50 μl)或整個樣品室底部(500 μl)。作為對照,將相同的稀釋細胞接種在96孔板(50 μl)或12孔板(500 μl)中。樣品和對照品在37°C和5%二氧化碳水平下孵育24小時。測試細胞毒性,以評估牙蠟對種子細胞質量的影響(圖3)。根據ISO 10993--5:2009標準測定細胞毒性。

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圖3:可見與EM ICE中板接觸的、在藍寶石盤側的牙蠟(紅色圈)。

 

為進行光學評估,用MTT對樣品進行了染色

活細胞可將MTT轉化生成甲臜,顏色由黃色變為紫色/藍色,可通過光度計的吸收測量來檢測。去除培養基,用50 μl或500 μl MTT溶液(DMEM中1 mg/ml)對細胞進行染色,在37℃,5%二氧化碳水平中孵育2小時。然后用50 μl或500 μl異丙醇替代染色劑。將溶液轉移到96孔板上,在波長范圍560 ~ 650 nm內測量吸收。細胞形態學的光學評估顯示,試驗樣品和對照樣品均為正常的成纖維細胞,如圖4所示。

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圖4:用MTT染色的陰性對照樣品


 

 

 


所有測試樣品的細胞活性為85±7%

結合形態學的評估,Coral Life工作流清楚地顯示,SampLink室作為非常合適的實驗工具,可以在任何活細胞實驗中,將您感興趣的細胞保持在特定的生理狀態


 


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