激光顯微鏡與傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡相比，具有高清晰度、高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，成為了該領(lǐng)域重要的成像工具。為什么共聚焦能得到如此多的寵愛(ài)，它又有哪些優(yōu)勢(shì)呢？本文列舉了三方面來(lái)論述共聚焦的優(yōu)勢(shì)。

　　只收集焦平面上的信號(hào)，使圖像由模糊變清晰

　　樣品比較厚的時(shí)候，普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡只能夠觀察到整體的樣品結(jié)構(gòu)，而共聚焦顯微鏡卻可以展現(xiàn)樣品輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

　　那么共聚焦顯微鏡是如何實(shí)現(xiàn)這一優(yōu)勢(shì)的呢？這就要?dú)w功于共聚焦的關(guān)鍵硬件—針孔（pinhole），如圖二所示，它是檢測(cè)器前面的一個(gè)小孔，放置在與樣品焦面共軛的光學(xué)平面上。當(dāng)激發(fā)光照射樣品時(shí)，焦面和非焦平面上的樣品區(qū)域都會(huì)被激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號(hào)，調(diào)節(jié)合適的針孔大小（通常為1 Au），使焦面上的熒光信號(hào)（綠色虛線）可以通過(guò)針孔到達(dá)檢測(cè)器，而非焦平面的熒光信號(hào)（紅色和藍(lán)色虛線）不能通過(guò)針孔到達(dá)檢測(cè)器。通過(guò)增加硬件針孔，使共聚焦在不改變普通熒光顯微鏡的制片方法的前提下，得到了清晰的高質(zhì)量圖像。

　　可連續(xù)獲取不同焦平面的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)三維重組

　　由于針孔的存在，我們能夠只獲取到焦平面上的信號(hào)，得到高分辨率的二維圖像。連續(xù)調(diào)節(jié)Z軸位置，就能夠得到不同Z軸位置的二維圖像，獲得一系列連續(xù)的“光學(xué)切片"圖像。獲得這些光學(xué)切片后，可使用儀器軟件配備的3D模塊進(jìn)行三維圖像的重組，構(gòu)建出清晰的3D圖像。這種無(wú)損傷的、連續(xù)的光學(xué)切片圖像的采集，實(shí)現(xiàn)了“細(xì)胞CT"的功能。

　　應(yīng)用于共定位(Co-localization)研究

　　共定位結(jié)果的精準(zhǔn)度與圖像的分辨率密切相關(guān)，所以我們?cè)谶M(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)需要選擇更高分辨率的成像方式。共聚焦顯微鏡相比于傳統(tǒng)顯微鏡以其高分辨率的優(yōu)勢(shì)，成為共定位研究的得力工具。

　　由于衍射極限的存在，激光顯微鏡常規(guī)共聚焦光學(xué)分辨率在200nm左右，當(dāng)我們需要觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)時(shí)，共聚焦就能夠準(zhǔn)確判斷其共定位程度。如果需要進(jìn)行共定位分析，可以選用共聚焦軟件中配備的共定位分析模塊。